Zo worden jouw laboratoriumtesten geanalyseerd

NGS is een verzamelnaam voor technologieën waarmee DNA en RNA op grote schaal worden uitgelezen. In tegenstelling tot oudere methoden zoals Sanger-sequencing, die fragmenten één voor één verwerken, leest NGS miljoenen fragmenten tegelijk. Zowel kleine, gerichte regio’s als volledige genomen kunnen zo snel en met hoge precisie worden geanalyseerd.

Er zijn twee hoofdbenaderingen. Short-read sequencing (bijvoorbeeld Illumina) leest korte fragmenten met hoge doorvoersnelheid en een laag foutenpercentage – ideaal voor variantdetectie en grootschalige toepassingen. Long-read sequencing (bijvoorbeeld Nanopore) leest langere fragmenten in één keer, wat het samenstellen van een genoom vergemakkelijkt en waardevol is voor epigenetisch onderzoek en repetitieve regio’s.

Het werkproces: eerst worden nucleïnezuren geïsoleerd en op kwaliteit gecontroleerd. Bij gerichte analyses wordt met PCR geamplificeerd en van een barcode voorzien; bij genoomsequencing wordt de barcode direct toegevoegd. Gelabelde samples worden samengevoegd (pooling) en gezuiverd met DNA-bindende beads. Tot slot worden adapters gekoppeld, die als startpunt voor het sequencen dienen. Het uitlezen zelf gebeurt in de flowcell – bij Illumina worden fragmenten geïmmobiliseerd en geamplificeerd, bij Nanopore worden moleculen door nanoporiën geleid waarbij elektroden het signaal detecteren.

PCR amplificeert (kleine fragmenten van) DNA of cDNA. Door miljoenen kopieën te maken, kunnen zelfs zeer kleine hoeveelheden genetisch materiaal worden geanalyseerd. Een PCR bestaat uit 20 tot 40 cycli met drie herhalende fasen: denaturatie, annealing en elongatie.

Tijdens denaturatie wordt het DNA verhit, waardoor de waterstofbruggen breken en twee enkelstrengige moleculen ontstaan. Bij annealing hechten korte stukjes DNA (primers) zich op een specifieke plaats, wat een startpunt creëert voor het polymerase. Tijdens elongatie verlengt het polymerase de primer met nieuwe nucleotiden tot een dubbelstrengs fragment. Deze stappen worden herhaald tot er voldoende kopieën zijn.

Hiervoor wordt een mastermix gebruikt: een buffer, dNTP’s (de bouwstenen), primers en een hittebestendig polymerase. Met forward- en reverseprimers worden beide DNA-strengen in elke cyclus gekopieerd. De hoeveelheid DNA neemt exponentieel toe: uit één fragment kunnen na 30 cycli een miljard kopieën ontstaan. Dit maakt PCR onmisbaar in de moderne diagnostiek.

16S rRNA-sequencing bepaalt de diversiteit, structuur en samenstelling van bacteriële gemeenschappen. In tegenstelling tot whole genome sequencing richt deze methode zich op één marker-gen dat aanwezig is in vrijwel alle bacteriën: het 16S rRNA-gen.

Dit gen bestaat uit geconserveerde en hypervariabele regio’s. De geconserveerde regio’s zijn vrijwel identiek in veel bacteriën en vormen de plek waar primers binden. De hypervariabele regio’s verschillen per soort en fungeren als moleculaire vingerafdruk. Voor het darmmicrobioom worden vaak de V3- en V4-regio’s gebruikt, al hangt de beste keuze af van de onderzoeksvraag en het platform.

De werkwijze: eerst wordt DNA geïsoleerd, daarna worden de gewenste regio’s met PCR selectief vermenigvuldigd, waarna de amplicons met next-generation of long-read sequencing worden uitgelezen. De sequenties worden met bio-informatica vergeleken met een referentiedatabase om te bepalen welke bacteriën aanwezig zijn en in welke relatieve verhouding.